Tipuri de microscoape fluorescente

Când microscoapele au fost inventate în jurul anului 1600 CE, filozofii naturali și-au îndreptat ochii spre o lume a unei lumi. Când Antony van Leeuwenhoek a creat lentile mici, curbate și un suport mecanic pentru reglarea vederii, a deschis o fereastră în lumea microscopică a bacteriilor, a celulelor sanguine, a protozoarelor și a structurii celulare a plantelor. Dar, de-a lungul istoriei microscopiei, a existat întotdeauna o întrebare: Care sunt aceste lucruri ciudate văzute printr-o lentilă? Microscopia fluorescentă se referă la un set de tehnici care minimizează această incertitudine - pentru că în cazul microscopiei fluorescente, când lumina strălucește pe o probă, luminează propria lumină înapoi.

Epifluorescența
De departe cel mai obișnuit microscop de fluorescență este configurația de epifluorescență. Într-un microscop de epifluorescență, o sursă de lumină - de obicei o lampă cu mercur sau xenon - strălucește printr-un filtru care selectează o regiune îngustă de lungimi de undă. Lumina filtrată strălucește pe eșantion prin lentila obiectivului microscopului. Lumina care intră este absorbită de fluorofori - etichete moleculare care emit lumină cu o lungime de undă lungă când absorb lumină cu o lungime de undă mai mică. Lumina de la fluorofori, împreună cu lumina împrăștiată de la sursa de iluminare, revine în obiectivul obiectivului și la detector sau ochi. De-a lungul drumului, un alt filtru blochează lumina de iluminare, astfel încât tot ce este lăsat este lumina fluorescentă din eșantion.

Confocal
Un microscop de epifluorescență colectează lumină de oriunde în câmpul de vedere al microscopului . Unele lumini de excitație sunt absorbite în fața planului focal al microscopului, unele în planul focal și altele din planul focal. Deoarece microscopul colectează toată această lumină, imaginea va conține o imagine clară a luminii în focalizare, dar va avea și lumină fără focalizare din alte regiuni. Un microscop confocal fixează faptul că prin focalizarea unui spot laser în același plan cu focalizarea microscopului. Apoi, o probă se duce în fața detectorului, unde blochează toată lumina care nu provine din focalizarea microscopului. Prin scanarea eșantionului, poate fi obținută o imagine tridimensională curată a obiectului.

Multiphoton
Într-un microscop confocal alinierea este foarte sensibilă. Dacă spotul laser, obiectivul microscopului, optica de colectare și orificiul de orificiu sunt oprite, chiar și în cea mai mică măsură, performanța microscopului suferă. Un microscop multiphotonic captează această problemă utilizând o lungime de undă a laserului care este doar jumătate din energia necesară pentru a excita fluoroforii din probă. Singura modalitate prin care fluoroforii vor fi excitați și vor emite fluorescență este dacă lumina laser este suficient de luminată încât două particule de lumină - fotoni - lovesc fluoroforul într-un timp foarte scurt. Acest lucru se întâmplă numai atunci când laserul este focalizat pe un loc foarte mic. Deci, singurul loc din eșantion care va emite lumină este locul unde laserul este focalizat, care păstrează imaginea frumos și curat pentru că nu există nici o lumină suplimentară de fundal pentru a scăpa - ceea ce înseamnă că nici o gaură nu se aliniază.

Fluorescența internă totală de reflecție (TIRF)
O altă modalitate de a obține imagini foarte clare este să vă asigurați că lumina de excitație nu ajunge prea departe în eșantion. Dacă o pată de neuroni, de exemplu, este plasată într-o picătură de soluție pe un diapozitiv de sticlă, atunci unii dintre neuroni vor adera la suprafața sticlei. Într-un microscop total de fluorescență prin reflexie internă (TIRF), lumina este îndreptată lateral în diapozitivul de sticlă, astfel încât nu se ajunge cu adevărat în soluția care ține celulele. Dar o parte din lumină abia scapă în soluție - foarte aproape de suprafața geamului. Aceasta înseamnă că singurele locuri care vor emite lumină vor fi într-o regiune foarte subțire de-a lungul suprafeței de sticlă. Pentru ceva asemănător cu neuronii, unde se petrec atât de multe lucruri interesante pe suprafața celulelor, această tehnică poate fi foarte eficientă.

Rezoluția superioară
Toate microscoapele - inclusiv microscoapele fluorescente - sunt limitate de fizica care guvernează propagarea luminii. Una dintre regulile de bază este că un spot focalizat de lumină poate deveni atât de mic - și nu mai mic. Pentru lumina vizibilă, această dimensiune este de aproximativ 200 nanometri, sau 200 de miliarde de un metru. Dar moleculele singulare sunt de numai câțiva nanometri, deci există o mulțime de caracteristici interesante care sunt sub această limită de dimensiune, numită limita de difracție. Oamenii de știință dezvoltă tehnici de "super-rezoluție" care să se strecoare în jurul acestei limite. Microscopia structurată cu microscopie (SIM) și microscopia stimulată de epuizare a emisiilor (STED), de exemplu, sunt metode de microscopie fluorescentă care limitează dimensiunea punctului de emisie a luminii prin micșorarea dimensiunii punctului de lumină excitație.
URL:https://ro.whycomputer.com/hardware/100507040.html