Tipuri de microscoape fluorescente

În anul 1600, când a fost inventat microscopul, filosofii naturali au descoperit o lume mică, ascunsă în interiorul celulelor. Antony van Leeuwenhoek a deschis această fereastră cu lentile mici și curbate și cu un suport mecanic pentru a regla vizualizarea. De-a lungul istoriei microscopiei, întrebarea rămâne: ce sunt acele obiecte strălucitoare văzute prin lentilă?

Microscopie fluorescentă se referă la o serie de tehnici care elimină această incertitudine. Atunci când un fascicul de lumină este direcționat spre un eșantion, acest eșantion răspunde emitem lumină proprie, creând un contrast clar.

Epifluorescență

Cel mai comun tip de microscop fluorescent este configurarea epifluorescentă. O sursă de lumină – de obicei o lampă de mercur sau xenon – emite lumină filtrată pentru a selecta o bandă restrânsă de lungimi de undă. Fascicul filtrat este concentrat prin obiectivul microscopului asupra eșantionului. Fluoroforele din eșantion absorb lumină de lungime de undă scurtă și emit lumină de lungime de undă mai lungă. Luminile emise, împreună cu cea dispersată de sursa de iluminare, pătrund înapoi prin obiectiv și ajung la detector sau la ochi. Un alt filtru elimină lumina de iluminare, lăsând doar lumina fluorescentă a eșantionului.

Microscop confocal

În contrast cu epifluorescența, un microscop confocal colectează lumină doar dintr-un singur plan focal. Un laser este focalizat în același plan ca și obiectivul microscopului. Un orificiu mic (pinhole) plasat în fața detectorului blocă orice lumină care nu provine din planul focal, eliminând lumina nefocusată din alte regiuni. Prin scanarea eșantionului, se obține o imagine tridimensională clară și fără zgomot.

Multiphoton

Microscoapele multiphoton îmbunătățesc sensibilitatea și rezoluția fără a necesita aliniere fină. Se utilizează un laser cu o lungime de undă mai mare (și, implicit, mai puțină energie per foton). Fluoroforele se excitează doar atunci când doi fotoni lovesc simultan fluoroforul într-un interval foarte scurt de timp, posibil doar când laserul este focalizat pe un punct foarte mic. Astfel, lumina emisă apare doar la poziția laserului, eliminând zgomotul de fundal și făcând nepotrivită utilizarea orificiului.

Fluorescență prin reflexie internă totală (TIRF)

TIRF este ideal pentru a observa structuri de pe suprafața celulelor. Lumină este direcționată lateral prin fața de sticlă a unui slide, creând un câmp evanescent care se extinde doar la câțiva nanometri de suprafață. Lumina este astfel absorbită doar în regiunea foarte apropiată de sticlă, permițând observarea interacțiunilor la suprafața celulelor fără interferență din partea restului soluției.

Rezoluție superioară

Clasic, rezoluția unui microscop este limitată de difracție – pentru lumina vizibilă, aceasta este în jur de 200 nm. Pentru a depăși această limită, cercetătorii folosesc tehnici de rezoluție superioară, cum ar fi microscopia cu iluminare structurată (SIM) și microscopia cu reducere a emisiunii stimulată (STED). Aceste metode reduc dimensiunea spotului de lumină emisă, permițând observarea unor structuri la scară nanometrică.